Nature子刊：阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）和阿爾茨海默病(AD)的聯系

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是睡眠呼吸障礙（SDB）中最常見的一種形式，是導致阿爾茨海默病發展的一個強有力的流行病學危險因素。據估計，大約 50% 的老年人患有阻塞性睡眠呼吸暫停（Obstructive Sleep Apnoea，OSA），他們的喉嚨肌肉在睡眠時間歇性收縮，阻塞氣道，導致呼吸停止和開始。當大腦缺氧時，會導致神經元的選擇性退化，這些神經元通常會在失智癥中死亡。

昆士蘭大學（University of Queensland，UQ）昆士蘭腦研究所（Queensland Brain Institute，QBI）和生物醫學科學學院（School of Biomedical Sciences）的 Elizabeth Coulson 教授和她的團隊在小鼠身上發現了睡眠時大腦缺氧和阿爾茨海默病之間的因果關系。研究結果近日發表在《Nature Communications》雜志上。

該研究團隊開發了一種小鼠SDB模型，該方法復制了人類條件的關鍵特征：睡眠時的呼吸改變、睡眠中斷、中度低氧血癥和認知障礙。當在家族性AD模型中誘導SDB時，小鼠表現出認知障礙的加重和AD的病理特征，包括淀粉樣蛋白和炎癥標志物水平的增加，以及膽堿能基底前腦神經元的選擇性變性。這些病理特征并不是單獨由慢性缺氧或睡眠中斷而引起的。我們的研究結果還顯示，膽堿能神經退行性變是由核缺氧誘導因子1 alpha的積累介導的。此外，在睡眠期間恢復血氧水平以防止缺氧，可以防止SDB引起的病理改變。這些發現提示了SDB誘導膽堿能基底前腦變性的信號機制。

將C57BL/6麻醉后，為了誘導膽堿能（ cMPT）病變，在背側被蓋核(laterodorsal tegmental nucleus) (LDT; AP, ?3.0?mm; ML, ±0.5?mm; DV, ?4.0?mm from Bregma, with the angle 34° backward)雙側注射 Urotensin II-SAPorin (UII- SAP; 0.07?μg/μl per site)。以相同的摩爾質量注射blank-SAPorin（Blank-SAP）或 IgG-SAPorin (IgG-SAP)作為對照。

為了測量睡眠狀態，采用無線遙測技術測量腦電圖（EEG）、肌電圖（EMG）和活動節律。腦電電極被放置于運動皮層（AP+1, ML+1?mm，左，相對于bregma）和視覺皮層（AP?3, ML+3?mm，右，相對于bregma）。腦電電極用骨科水泥固定。肌電電極被錨定在斜方肌中。使用不可吸收的6-0縫合線材料縫合頭皮。

電極放置手術兩周后，以500 Hz的采樣頻率記錄腦電圖和肌電圖。采用嚙齒動物睡眠評分軟件對清醒、REM或non REM（NREM）睡眠進行腦電圖和EMG記錄。REM期只有在≥1s長時才被考慮。由于電極放置而造成明顯腦損傷的對照組小鼠被排除在分析之外。

另一組小鼠使用代謝表型系統進行72小時的睡眠/覺醒參數評估，預先編程的光周期和光亮度控制晝夜節律。如果小鼠有≥10分鐘沒有運動，則認為它們睡著了。

使用全身體積描記系統對小鼠進行連續4小時的評估，期間記錄呼吸，同時記錄其他不受限制、自由運動的小鼠的腦電圖。小鼠被放置在一個全身體積描記器中。這種方法提供了一種間接的潮氣量測量，它與密封腔室呼吸過程中產生的循環腔室壓力信號成正比。首先讓小鼠30 min適應環境，然后持續記錄3小時數據。

使用MouseOx Plus小鼠脈搏血氧儀在室內空氣或環境室內記錄不受限制的清醒小鼠的動脈血氧飽和度。數據收集至少30 min，測量時儀器不能顯示錯誤代碼。然后對每只實驗條件的每只小鼠計算氧飽和度水平。

在一個正方形白色有機玻璃盒子（30 cm×30 cm）中進行30 min的曠場實驗。實驗箱被分為一個中心區（中心，15cm×15cm）和一個邊區（邊界）。使用攝像機記錄鼠標的運動，并使用視頻行為學系統軟件進行分析。以動物身體中心為參考點，計算總軌跡長度。

Y迷宮由三個由有機玻璃組成的等距臂（120°，長35cm，寬10cm）組成。在訓練期間，小鼠被放置在其中一只臂（開始臂）中進入另一只臂，持續15 min。訓練后的一天，小鼠被允許在Y迷宮中探索10 min，并進入所有三個手臂。使用視頻行為學系統軟件對動物進行跟蹤，并分析在每只臂上花費的總時間和時間百分比。

任務過程包括三個階段：適應、熟悉化和測試階段。在適應階段，小鼠被允許自由探索場地（40 cm×40cm）5 min。在熟悉階段，他們被放置在包含兩個相同樣本物體的場地，5 min，兩個物體都位于場地相對和對稱的角落。在1小時的記憶保留間隔后，小鼠和兩個物體放回到場地，一個與樣本相同，另一個為新物體，允許動物再次探索5 min。使用視頻行為學系統軟件跟蹤動物，并分析探索物體的時間百分比。

該裝置由一個高架測試場組成，網格地板有一個透明的圓形邊界，側壁安裝視頻采集系統。測試場地順時針旋轉（1轉/分），電刺激可以通過網格地板傳遞。在適應后的第二天，小鼠每天進行4或5天的訓練，每天訓練小鼠持續10 min，避免 60° 的電擊區，進入后導致短暫的足部電擊（500 ms，0.5 mA）。為了確定它們對電擊區的記憶，在最后一次訓練結束24小時后，小鼠被允許在不施加電擊的情況下探索場地10 min。使用視頻行為學系統軟件跟蹤分析動物行為。

被動位置回避行為范式被用于測試基礎前腦依賴的idiothetic navigation（依賴于自身運動信息的導航，自我主張）。這個導航任務使用了與主動位置回避任務相同的設備。然而，所有的外部線索都被消除，以減少allothetic navigation（依賴于外界信息的導航策略，異源導航），圓形邊界是不透明的灰色，競技場在整個實驗過程中保持靜止。小鼠經歷了5 min的適應階段，然后是10 min的訓練階段，訓練階段間隔1小時。訓練24小時后，小鼠被允許在電擊場不施加電擊探索5 min。

訓練小鼠在水下1.5cm處找到一個平臺，在游泳時老鼠看不見它。每天進行3次試驗，每次60秒，試驗間隔30個min。在每次試驗中，小鼠以偽隨機的順序以三個標定的起點中的一個放入水箱中。如果老鼠在60秒內未能找到平臺，它們會被手動引導到平臺，并允許在平臺停留至少20秒。小鼠根據需要被訓練5天，以達到15s（逃避潛伏期）的訓練標準。探索實驗安排在最后一次訓練后24小時，包括一個沒有平臺的60秒試驗。使用視頻行為學系統軟件跟蹤測量動物游泳軌跡。

8只小鼠被放置在一個充滿水的睡眠剝奪箱（55cm×25cm）內，籠子里有9個圓柱體（直徑3cm），離水面1cm。睡眠剝奪籠和對照籠（有圓柱體，但無水）被放在一個氣候室（27?°C ，25% RH，光照周期為12：12小時）里。小鼠被放置在睡眠剝奪籠子中20小時和普通飼養籠中4小時。飼養籠在光照周期中光照的4小時也放置在在氣候柜中。小鼠通過視頻進行監測，并每天稱重。

Fig. 2: Urotensin II-SAPorin處理影響呼吸模式，在睡眠期間會誘發血氧不足。

在清醒（A、B）或睡眠（C、D）期間注射對照空白SAP（A、C）或UII-SAP（B、D），采用全身體積描記記錄和對應的EEG記錄下進行靜態呼吸測量。統計數據是指對雄性和雌性小鼠的睡眠-覺醒配對雙向方差分析和Levene方差檢驗。

E UII-SAP組或對照組空白-SAP組雄性小鼠的平均多導睡眠測量（睡眠-覺醒配對雙向方差分析）f頻率，PIF峰值吸氣流量，PEF峰值呼氣流量，EIP吸氣時間，EEP呼氣時間，RT：

F注射UII-SAP和空白SAP的雄性小鼠在睡眠期間的清醒活動狀態的平均血氧飽和度水平。

G 注射了UII-SAP或對照組空白-SAP的雄性小鼠血氧飽和度水平的代表性趨勢圖。

數據表明， cMPT損傷的小鼠在睡眠期間具有高度可變的呼吸模式，平均而言，這與由于上呼吸道阻力而發生的吸入和呼氣措施的預測改變相一致，呼吸對呼吸的變化表明了由缺氧引發的恢復反應。大多數受損小鼠在睡眠中也表現出幾秒鐘的呼吸頻率下降，隨后是覺醒，這可以被解釋為呼吸暫停事件。此外，與最常見的SDB形式一致，在休息時，當 cMPT損傷小鼠在睡眠期間血氧測量30 min，發現血氧飽和度在80-90%左右，顯著低于空白小鼠的>95%（圖2F，G）。該結果表明， cMPT損傷影響呼吸模式，導致睡眠期間的輕度缺氧，這與氣道阻塞相一致。

A 在亮燈（睡眠）和不亮燈（清醒）期間，REM、NREM和清醒期的平均數量。

B在亮燈（睡眠）和不亮燈（清醒）期間，REM、NREM和清醒睡眠的平均次數。

C 在開燈（睡眠）和不亮燈（清醒）期間，REM、NREM和清醒睡眠的平均長度。

D損傷（灰色）和UTII-SAP（紅色）損傷小鼠在睡眠狀態和睡眠和清醒之間移動的平均轉換次數。E在活動記錄的前48小時內，持續睡眠（持續至少10 min）的平均數量和時間和在12小時光照階段不活動的總時間

F在前48小時的12小時光期中不活動的總時間。

G一只對照組和一只受損傷的小鼠在12：12小時的光照：暗周期中超過3天的活動周期圖。在黑暗期的第3天，小鼠暴露于30 Lux昏暗的光線下3小時。

H實驗第3天12 h光期3h弱光期的活動時間。在注射UII-SAP（紫色）后2周開始的睡眠期2周內，小鼠每天放置40%含氧（高氧o2）8小時，與注射UTII-SAP的小鼠相比，沒有睡眠不足。

A與熟悉（Fam）臂相比，在Y迷宮的新臂上花費的時間百分比。注射空白SAP的小鼠表現出對新臂的偏好，而 cMPT損傷的小鼠沒有偏好。

B Morris水迷宮訓練階段的逃逸潛伏期。在過去兩天的訓練中， cMPT損傷的APP/PS1小鼠尋找逃逸平臺的時間明顯更多。

C在Morris水迷宮的探索測試中到達平臺位置的潛伏期。兩組間的逃逸潛伏期無顯著性差異。

D主動位置回避試驗中每個訓練日小鼠接受的電擊次數。cMPT損傷的APP/PS1小鼠在最后兩天接受了明顯更多的電擊。

E  cMPT損傷的APP/PS1小鼠所接受的電擊次數顯著高于非損傷的APP/PS1小鼠

A與熟悉的臂相比，在Y迷宮的新臂上花費的時間百分比。APP/PS1小鼠表現出對新臂的偏好，而睡眠剝奪的小鼠沒有偏好。

B C57Bl6小鼠在睡眠剝奪后的cBF神經元數量與對照組小鼠相當。

C海馬和皮質裂解液中可溶性Aβ的量未因睡眠剝奪而改變。

D APP/PS1小鼠海馬和皮層的面積受年齡影響，但不受睡眠剝奪的影響。

為了測試cBF神經元是否因暴露于慢性缺氧條件而死亡，野生型雄性小鼠在睡眠期間每天暴露于降低的（80%）的氧氣條件下8小時，持續4周。在這一時期，cBF神經元的數量受到日常慢性缺氧沒有顯著不同的老鼠連續安置在常氧，表明慢性缺氧不能觸發相同的退行性途徑引起的 cMPT損傷。相比之下，慢性間歇性缺氧已被報道可誘導cBF神經元變性。

A C67Bl6小鼠在每日睡眠時間內每天在缺氧條件下暴露4周后的cBF神經元數量。

B 在空白-SAP（灰色）或UII-SAP小鼠中，每日用15mg/kg2ME2（藍色）或載體（紅色）處理3周后，細胞核中存在HIF1α免疫染色的cBF神經元的百分比。

C 4只動物的基底前腦切片的代表性共聚焦圖像，經ChAT（紅色）、HIF1α（綠色）和細胞核（DAPI；藍色）免疫染色。注射Blank-SAP（灰色）或UII-SAP，每天用15mg/kg2ME2（藍色）或載體（紅色）

D,E 處理3周后，小鼠cLDT (D)和cBF (E)神經元的數量。2ME2治療可保護cBF神經元免受損傷的影響。

F 在被動位置回避任務的測試階段，2ME2處理（藍色條）和未處理的UII-SAP損傷（紅色條）小鼠與空白SAP損傷小鼠（灰色條）的表現。

G UII-SAP注射的ChAT-cre HIF-1αfl/wt小鼠的cBF神經元數量與空白-SAP注射的ChAT-cre HIF-1αfl/wt小鼠無顯著差異。

人類患者阻塞性睡眠呼吸暫停的標準治療是在睡眠期間使用持續氣道正壓（CPAP）治療，這是在物理上維持氣道開放，從而防止血氧飽和度下降和睡眠喚醒。為了驗證對SDB小鼠在高氧環境下的睡眠階段進行治療是否可以保護cBF神經元免受 cMPT損傷誘導的細胞死亡和/或Aβ積累。

研究團隊使用高氧（40%）環境，將 cMPT損傷小鼠在睡眠階段的血氧水平恢復到>為95%的spo2。從病變手術后2周開始，年老的APP/PS1小鼠在12小時睡眠期間每天接受高氧治療，持續4周。該治療對 cMPT病變的范圍沒有影響。

然而，APP/PS1中cBF神經元的數量（圖9b；和野生型圖3E）高氧處理的 cMPT損傷動物明顯高于未處理的損傷小鼠，與標準飼養籠中的假損傷動物相似（圖9B），從而證實了cBF變性是SDB表型的結果。

此外，在損傷的APP/PS1隊列中，每日高氧治療顯著降低了淀粉樣蛋白病理程度（圖9C、E）和炎癥程度（圖9F-H）。

APP/PS1小鼠注射UII-SAP并經常氧或高氧處理后，

cLDT (A)和cBF (B)神經元的數量

新皮質中硫黃素-s陽性Aβ斑塊的數量（C）和面積（D）。

新皮質中GFAP陽性小膠質細胞的密度（E）和面積（F）。

新皮質中cd68陽性星形膠質細胞的密度（G）和面積（H）。

睡眠呼吸障礙會導致睡眠期間大腦缺氧，大腦缺氧會導致神經元的選擇性退化，而這些退化神經元，通常會在癡呆癥中死亡。當研究人員剝奪小鼠睡眠時，并沒有發現引起與這種睡眠呼吸障礙相同的病理特征，即便是睡眠剝奪確實會損害記憶。研究人員認為，睡眠呼吸暫停似乎是導致阿爾茨海默氏癥發展的風險因素。

“目前還沒有有效逆轉阿爾茨海默病的方法，因此預防疾病的發生就顯得尤為重要。這就需要我們了解哪些原因能導致特發性疾病的發生。"錢磊博士指出，“睡眠呼吸障礙是癡呆癥發生的一個重要的流行病學風險因素，與發病年齡提前、認知能力下降增快有關。我們的工作為這種流行病學聯系提供了機制，也對識別高危人群具有重要意義。"

Elizabeth Coulson教授表示：“下一步我們將利用已有的動物模型，研究在睡眠呼吸障礙過程中，參與基底前腦膽堿能神經元病變的分子通路，并尋找潛在的候選分子阻止上述病變發生。此外，一項關聯睡眠呼吸障礙、MRI腦成像與癡呆癥的臨床試驗也在進行，進一步確認對睡眠呼吸障礙的干預是否能延緩或阻止癡呆癥的發生。"

Qian, L., Rawashdeh, O., Kasas, L. et al. Cholinergic basal forebrain degeneration due to sleep-disordered breathing exacerbates pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat Commun 13, 6543 (2022).